【產(chǎn)品名稱】

　　單核增生李斯特氏菌核酸快速檢測(cè)試劑盒

　　【產(chǎn)品簡(jiǎn)介】

　　本試劑盒基于環(huán)介導(dǎo)的恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)，用于食品中單核增生李斯特氏菌的快速檢測(cè)，可借助顯色指示劑直接判讀結(jié)果。

　　【檢測(cè)原理】

　　利用兩對(duì)特殊引物和具有鏈置換活性的Bst DNA聚合酶，使模板兩端引物結(jié)合處循環(huán)出現(xiàn)環(huán)狀單鏈結(jié)構(gòu)，引物順利與模板結(jié)合并進(jìn)行鏈置換擴(kuò)增反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)在恒溫條件下(60-65℃)進(jìn)行連續(xù)快速擴(kuò)增。反應(yīng)加入顯色指示劑，陰陽性結(jié)果顯色差異顯著，可直接通過顏色變化判讀結(jié)果。

　　【產(chǎn)品特點(diǎn)】

　　1. 快速簡(jiǎn)便：將酶、引物等反應(yīng)組分混勻后進(jìn)行干粉化處理，增加試劑穩(wěn)定性，使用時(shí)減少溶液配制步驟，更為便捷，整個(gè)檢測(cè)反應(yīng)可在1 h內(nèi)完成;

　　2. 特異性高：利用靶基因序列上的多個(gè)獨(dú)立區(qū)域設(shè)計(jì)多條引物，保障擴(kuò)增反應(yīng)的高度特異性;

　　3. 靈敏度高：檢驗(yàn)限達(dá)到8 CFU/Test;

　　4. 判讀簡(jiǎn)單：反應(yīng)前加入顯色指示劑，反應(yīng)后通過肉眼觀察反應(yīng)液顏色變化或者經(jīng)熒光監(jiān)測(cè)儀器跟蹤熒光圖譜的變化判讀結(jié)果，直觀方便，且可有效避免反應(yīng)后開蓋造成的氣溶膠污染。

　　【產(chǎn)品組分】

　　【儲(chǔ)存條件與保質(zhì)期】

　　2~8℃條件下儲(chǔ)存，有效期為12個(gè)月

　　【適用儀器】

　　1. PCR儀器或金屬浴恒溫器，如果檢測(cè)樣品為DNA樣品，水浴鍋即可。

　　2. 高速離心機(jī)，樣品的前處理需要用高速離心機(jī)做分離。

　　【樣品富集】

　　1. 樣品前處理：取25 g待檢樣品置于225 mL李氏增菌肉湯(LB1)中，前增菌10-12 h，對(duì)增菌液中的菌體富集用于LAMP快速檢測(cè)。

　　2. 適用樣品類型：增菌液或者可疑菌落樣品。

　　3. 待測(cè)樣品存放：粗提的待檢DNA樣品保存于-4~0℃，不應(yīng)該超過24 h;利用試劑盒提取的DNA樣品可在-20℃長(zhǎng)期保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。

　　【使用指南】

　　1. 樣品前處理

　　A. 樣品增菌液模板DNA的制備：

　　a) 吸增菌液1 mL到1.5 mL規(guī)格的無菌離心管中，6000 r/min離心5 min，棄上清;

　　b) 加入30 μL裂解液，充分懸浮菌體，輕彈管壁消除氣泡，99℃加熱10 min。

　　c) 12000 r/min離心15 min，上清即為粗提的DNA，可轉(zhuǎn)移至0.2 mL無菌離心管中，在-20℃下可長(zhǎng)期保存。

　　B. 可疑菌落模板DNA的制備：

　　挑取可疑菌落，懸浮到含30 μL裂解液的無菌離心管中，后按照上述步驟b)、c)操作。

　　2. 陰、陽性對(duì)照和干粉試劑復(fù)溶

　　A. 陰、陽性對(duì)照復(fù)溶

　　    使用時(shí)，加入80 μL超純水至陽性對(duì)照和陰性對(duì)照凍干粉中，待溶解后混勻，-20℃存儲(chǔ)待用。

　　B. 干粉試劑復(fù)溶

　　取出凍干粉試劑，按照需求剪取n個(gè)檢測(cè)試劑管(n=待檢測(cè)樣品數(shù)+1管陽性對(duì)照+1管陰性對(duì)照)，每管加入20 μL復(fù)溶液，全溶解后待用。

　　3. 擴(kuò)增反應(yīng)

　　A. 打開能夠提供恒溫條件的儀器，設(shè)置到63℃待用;

　　B. 向上述已加入復(fù)溶液的n個(gè)反應(yīng)管中各加入顯色指示劑2.5 μL;

　　C. 向上述已加入復(fù)溶液的n個(gè)反應(yīng)管中分別加入待測(cè)樣品核酸、陰性對(duì)照、陽性對(duì)照各2.5 μL，蓋緊蓋子;

　　D. 將所有的反應(yīng)管置于恒溫儀器中，恒溫63℃反應(yīng)50 min。

　　4. 結(jié)果判讀

　　反應(yīng)結(jié)束后，建議在自然光線充足的環(huán)境條件下，將樣品置于白色背景下觀察結(jié)果，陰性對(duì)照檢測(cè)試劑管呈淡橙色，陽性對(duì)照檢測(cè)試劑管呈熒光綠，待測(cè)樣品反應(yīng)管以此作為對(duì)照進(jìn)行判讀，若陰陽對(duì)照反應(yīng)管任一結(jié)果與上述情況不符，則本次檢測(cè)結(jié)果無效，應(yīng)重新檢測(cè)或與產(chǎn)品技術(shù)支持聯(lián)系。